Née d'un père inconnu et d'une mère comptable d'origine italienne, Sylvie Testud grandit dans le quartier populaire de la Croix-Rousse à Lyon. Très tôt fascinée par le cinéma, la jeune fille s'identifie notamment au personnage d'ado complexée incarné par Charlotte Gainsbourg dans L' Effrontée. Montée à Paris pour suivre des études d'histoire, elle se lance bientôt dans la comédie en intègrant la classe libre du Cours Florent puis le Conservatoire, où elle a pour professeurs Jacques Lassalle et Catherine Hiegel. Elle fait sa première apparition à l'écran en 1994 dans Couples et amants.

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La même année, Sylvie Testud est engagée pour une coproduction franco-allemande, Maries Lied. Mais les Français se retirent du projet, et l'actrice est promue, lors de la sortie de ce film remarqué, jeune espoir du cinéma d'outre-Rhin. Pour les besoins de Jenseits der Stille, elle apprend la langue de Goethe, mais aussi la clarinette et le langage des signes, une performance qui lui vaut l'équivalent allemand du César de la Meilleure actrice. C'est en 1999 que les Français découvrent le sourire malicieux de Sylvie Testud dans Karnaval , la chronique dunkerquoise de Thomas Vincent. Choisie par Akerman pour être l'héroïne de La Captive (2000), adaptation de La Prisonnière de Proust , elle apparaît ensuite chez Jacquot et Oliveira.

En 2000, l'actrice frêle et rieuse révèle une violence insoupçonnée en incarnant Christine Papin dans Les Blessures assassines de Jean-Pierre Denis, une prestation récompensée par un César du meilleur espoir. Affectionnant les personnages troubles et décalés -serial killer dans Dédales, voleuse dans Filles uniques , Sylvie Testud obtient en 2004 le César de la Meilleure actrice pour Stupeur et tremblements de Corneau, le récit plein d'ironie d'une descente aux enfers dans le monde de l'entreprise japonaise, d'après le best seller de Nothomb. Devenue une actrice de premier plan, elle poursuit dans cette veine burlesque avec Cause toujours ! de Jeanne Labrune et Demain on déménage de sa complice Akerman, mais c'est sur le terrain du mélodrame que l'emmène sa seconde collaboration avec Corneau ( Les Mots bleus , 2005).

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Sylvie Testud est maman depuis le mardi 15 février 2005 d'un petit garçon prénommé Ruben.